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利拉鲁肽通过PI3K/Akt和AMPK信号通路改善糖尿病大鼠认知损伤的机制研究认领

作者：

杨莹

学位授予单位：

河北医科大学

摘要：

2型糖尿病(Type2 Diabetes Mellitus,T2DM)是一种人类常见的代谢紊乱综合征，是由于异常的胰岛素分泌和/或作用引起，以高血糖为主要特征，并且近年来T2DM发病率呈逐渐上升趋势。大量实验结果表明T2DM患者常伴有不同程度的认知功能损害，如学习和记忆障碍，运动效率降低和注意力下降等。DM相关的认知功能下降因其对DM患者的有害影响而越来越受到关注，然而，预防这种病变的临床干预措施却很少。　　利拉鲁肽(Liraglutide)是胰高糖素样肽1(Glucagon-like peptide-1, GLP-1 )类似物，可以穿过血脑屏障并与大脑神经元中的GLP-1受体(GLP-1R)结合，在神经变性和神经发生中发挥神经营养和神经保护作用。据报道，利拉鲁肽外周给药可刺激神经发生，减少细胞凋亡，在体内和体外研究中都表现出对认知功能和海马突触可塑性的有益作用。同时有研究显示利拉鲁肽能通过AMPK/mTOR通路介导上调自噬相关基因表达，促进自噬空泡形成。综上所述，利拉鲁肽能够作为神经保护剂拥有非常好的应用前景，在神经系统中发挥至关重要的作用。在前期预实验工作的基础上，通过检索和阅读文献，我们推测利拉鲁肽能够改善T2DM大鼠的认知功能障碍，提高大鼠学习记忆能力，减少神经细胞凋亡，激活自噬，改善突触可塑性。其潜在机制可能与PI3K/Akt和AMPK通路的介导有关。为了证明我们的预期结论，本课题将以三部分的实验形式进行相关论述。　　第一部分利拉鲁肽对糖尿病大鼠的糖脂代谢影响和神经保护作用　　目的：分析糖尿病大鼠认知功能改变，探索利拉鲁肽对糖尿病大鼠的糖脂代谢影响和神经保护作用。　　方法：选取SPF级雄性32周龄GKr大鼠30只，Wistar大鼠15只，实验分为三组：对照组(Control组)、糖尿病组(DM组)、糖尿病+利拉鲁肽治疗组(DM+Lira组)。DM+Lira组以200μg/kg剂量于每天固定时间皮下注射利拉鲁肽(1/日，连续4周)，Control组和DM组分别给予等量的生理盐水。检测指标如下：1)于实验第1天和第28天测量大鼠体重和血脂;2)于第1、7、14、21和28天测量大鼠空腹血糖，于实验第1、14、28天检测大鼠空腹胰岛素水平，计算胰岛素抵抗指数HOMA-IR数值;3)应用Morris水迷宫、Y迷宫来检测各组大鼠认知功能水平。4)应用免疫组化染色观察不同组大鼠脑组织海马GLP-1R的表达。　　结果：　　1.体重和血脂情况：实验第1天，DM组和DM+Lira组GK大鼠体重高于Control组Wiatar大鼠，DM组和DM+Lira组大鼠血清TC、LDL-C和TG均高于Control组;实验第28天与DM组大鼠体重相比，DM+Lira组大鼠体重有所下降，血清TC和LDL-C明显下降，而TG无明显变化;2.大鼠空腹血糖测定：实验第7、14、21天，DM+Lira组大鼠空腹血糖相较DM组有明显下降，逐渐趋于达到正常水平。与Control组相比，DM组空腹胰岛素和HOMA-IR升高，当应用利拉鲁肽治疗14天后，DM+Lira组空腹胰岛素和HOMA-IR有所下降，并维持至28天时;3.行为学实验结果：Morris水迷宫中DM组的大鼠逃避潜伏期比Control组明显延长，DM+Lira组大鼠逃避潜伏期明显缩短;Y迷宫实验结果中与Control组相比，DM组和DM+Lira组大鼠实验中错误次数(EN)显著增加，总反应时间(TRT)延长。利拉鲁肽治疗后，大鼠EN减少，TRT明显缩短;4.GLP-1R在海马组织中的免疫组化实验中的表达　　GLP-1R能够在Control组大鼠海马组织广泛表达，DM组大鼠GLP-1R表达量显著低于Control组。当给予利拉鲁肽干预后，大鼠海马GLP-1R表达显著增加。　　小结：糖尿病大鼠存在糖脂代谢紊乱、胰岛素抵抗和体重增加，应用利拉鲁肽干预后，显著改善糖脂代谢，减轻胰岛素抵抗，降低糖尿病大鼠体重。行为学实验发现，利拉鲁肽治疗能够改善大鼠认知记忆功能障碍。另外GLP-1R广泛表达于大鼠海马神经细胞，给予利拉鲁肽治疗能够明显增加GLP-1R的表达。　　第二部分利拉鲁肽在糖尿病脑损伤中通过PI3K/Akt和AMPK信号通路调控自噬功能和细胞凋亡　　目的：探讨利拉鲁肽能否通过PI3K/Akt通路和AMPK通路激活自噬，减少细胞凋亡，改善糖尿病大鼠认知功能。　　方法：60只雄性GK大鼠被随机分为六组，10只雄性Wistar大鼠作为对照组，实验分为七组：对照组(Control组)、糖尿病组(DM组)、利拉鲁肽低剂量组(Lira-L组)、利拉鲁肽高剂量组(Lira-H组)、糖尿病+Lira-H+LY294002组(LY294002组)、糖尿病+Lira-H+CompoundC组(CompoundC组)、糖尿病+Lira-H+LY294002+CompoundC组(LY294002+CompoundC组)。对下列指标进行检测：1)Morris水迷宫试验评估大鼠认知功能情况;2)尼氏染色(Nissl Staining)观察大鼠海马组织神经元结构和损伤程度;3)Western-blot蛋白测定实验28天时各组大鼠脑组织PI3K，totalAkt，p-Akt，totalAMPK，p-AMPK，Caspase-3，Bcl-2,Bax,Beclin-1，LC-3Ⅰ，LC-3Ⅱ蛋白表达情况。　　结果：　　1.Morris水迷宫实验结果：与Control组相比，DM组大鼠逃避潜伏期时间明显延长，目标象限停留时间缩短，Lira-L组大鼠逃避潜伏期有所缩短，目标象限停留时间有所延长，Lira-H组大鼠逃避潜伏期更加缩短，目标象限停留时间明显延长。当给予LY294002后，大鼠逃避潜伏期明显延长，目标象限停留时间缩短。同样的，给予CompoundC后，DM+Lira-H+CompoundC组大鼠逃避潜伏期延长，目标象限停留时间显著缩短。LY294002和CompoundC双抑制剂组大鼠逃避潜伏期明显延长，目标象限停留时间明显缩短;2.尼氏染色结果：Control组大鼠脑神经元形态基本正常，DM组大鼠神经细胞存在变性坏死，Lira-L组大鼠海马神经元萎缩现象有所减少，Lira-H组大鼠海马神经元缺失明显减少;分别加入LY294002和CompoundC后神经元明显丢失，双抑制剂组大鼠海马细胞萎缩和细胞核裂解现象增多;3.脑组织免疫印迹分析结果：与Control组相比，DM组大鼠脑组织Beclin-1、LC3-II/LC3-I比值、PI3K、p-Akt/Akt比值、p-AMPK/AMPK比值均有所下降，p-m-TOR/m-TOR比值、Bax/Bcl-2比值和Caspase-3蛋白有所上升。当给予低剂量利拉鲁肽治疗后，Beclin-1、LC3-II/LC3-I比值、PI3K、p-Akt/Akt比值、p-AMPK/AMPK比值升高，p-m-TOR/m-TOR比值、Bax/Bcl-2比值和Caspase-3蛋白表达水平降低。高剂量利拉鲁肽处理后自噬激活、PI3K/Akt和AMPK通路激活效果更强。当分别给予LY294002和/或CompoundC后，Beclin-1、LC3-II/LC3-I比值、p-Akt/Akt比值、p-AMPK/AMPK比值下降，p-m-TOR/m-TOR比值、Bax/Bcl-2和Caspase-3蛋白水平比值升高。　　小结:利拉鲁肽改善糖尿病大鼠认知损伤呈剂量依赖性，利拉鲁肽能够通过激活PI3K/Akt和AMPK信号通路，激活自噬，减少细胞凋亡改善糖尿病大鼠的认知功能障碍。　　第三部分GLP-1受体激动和自噬激活抑制高糖诱导的大鼠海马神经元凋亡　　目的：探索利拉鲁肽对高糖诱导的大鼠海马神经元自噬过程的影响，分析利拉鲁肽能否通过激活自噬过程减轻高糖诱导的大鼠海马神经元凋亡。　　方法：选取出生1天的Wistar大鼠进行原代海马细胞培养，给予或不给予梯度利拉鲁肽干预(1，10，100和200mmol/L)在正常葡萄糖(5.5 mmol/L)和高糖环境下(30 mmol/L)分别诱导24、48、72和96小时后，应用CCK8法检测细胞活性，选择最佳药物浓度和最佳作用时间用于后续实验。实验分为五组：正常组(NG组)、高糖组(HG组)、利拉鲁肽高糖干预组(HG+Lira组)、3-甲基腺嘌呤高糖干预组(HG+3-MA组)、利拉鲁肽加3-甲基腺嘌呤高糖组(HG+Lira+3-MA组)。3-甲基腺嘌呤以5mmol/L的浓度加入培养基中。对下列指标进行检测：1)Western-blot蛋白测定Beclin-1、P62、Caspase-8、Bax/Bcl-2蛋白表达情况;2)实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(real-time qPCR)测定Beclin-1、P62、Caspase-8、Bax/Bcl-2mRNA表达情况;3)TUNEL法检测各组神经元细胞凋亡情况。4)免疫荧光检测P62与Caspase-8在大鼠脑神经元共表达。　　结果：　　1.免疫印迹分析结果：与NG组相比，HG组Beclin-1蛋白表达降低，P62、Caspase-8、Bax/Bcl-2比值升高，HG+Lira组Beclin-1表达水平升高，P62、Caspase-8、Bax/Bcl-2比值降低。HG+Lira+3-MA组神经元Beclin-1蛋白表达量极低，P62、Caspase-8、Bax/Bcl-2比值升高;2.Real-timeqPCR结果：与NG组相比，HG组Beclin-1mRNA表达下降，P62、Caspase-8和Bax/Bcl-2mRNA表达增加;HG+3-MA组Beclin-1mRNA表达水平显著下降，而P62、Caspase-8和Bax/Bcl-2mRNA表达上升。HG+Lira组Beclin-1mRNA表达水平显著升高，而P62、Caspase-8和Bax/Bcl-2mRNA表达下降;HG+Lira+3-MA组神经元Beclin-1mRNA表达量极低，P62、Caspase-8和Bax/Bcl-2mRNA表达明显增加;3.TUNEL结果显示：NG组中凋亡神经元细胞较少，HG组凋亡神经元数目增多，HG+3-MA组神经元凋亡最多。HG+Lira组神经元凋亡有所减少，HG+Lira+3-MA组神经元凋亡数目显著增加。　　4.免疫荧光结果：免疫荧光强度值分析结果显示NG组神经元细胞P62和Caspase-8都有少量表达，P62与Caspase-8在HG组神经元中表达明显增多。P62与Caspase-8在大鼠脑神经元共表达，且随着利拉鲁肽的加入其共表达阳性细胞数明显减少，HG+Lira+3-MA组神经元P62与Caspase-8的表达都激活。　　小结:高糖诱导的大鼠海马神经元自噬功能发生障碍，自噬功能激活能够抑制神经细胞凋亡，相反自噬功能受到抑制后，凋亡细胞数目增加。利拉鲁肽可通过激活自噬，抑制神经元凋亡，发挥神经保护作用，可能与P62与Caspase-8相结合发挥作用有关。　　结论：高糖能够使大鼠海马神经元自噬功能发生障碍，自噬功能激活能够抑制神经细胞凋亡，利拉鲁肽可通过激活自噬，抑制神经元凋亡，发挥神经保护作用。

摘要译文

关键词：

糖尿病; 认知功能障碍; 利拉鲁肽; 胰高糖素样肽1; 神经保护

学位年度：

2019

学位类型：

博士

学科专业：

内科学

导师：

房辉

中图分类号：

R587.1[糖尿病⑨]

学科分类号：

100201[内科学]