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基于Wnt/β-catenin信号通路探讨藏药三果汤抑制高糖状态下胰岛β细胞凋亡的实验研究认领

作者：

龙小妹

学位授予单位：

云南中医药大学

摘要：

目的:糖尿病是一种内分泌代谢性疾病,近年来,其发病率显著上升,严重威胁着人类健康。糖毒性诱导胰岛β细胞凋亡是糖尿病发生发展的一个重要因素。由诃子、毛诃子、余甘子组成的藏药三果汤是一种常用于治疗糖尿病的藏药经方,国内多家藏医院应用此方治疗糖尿病患者已取得较好的临床疗效。课题组前期实验表明,藏药三果汤可抑制糖尿病大鼠胰岛β细胞凋亡并促进其增殖,其机制可能与Wnt/β-catenin信号通路有关联。因此,本实验旨在建立高糖诱导胰岛β细胞凋亡的体内外模型,深入研究藏药三果汤在高糖条件下抑制胰岛β细胞凋亡的作用和机制,并进一步探讨Wnt/β-catenin信号通路在这一现象中的可能机制,以期能够为糖尿病的治疗提供新思路。方法:1.不同产地藏药三果汤的指纹图谱建立及水提取工艺优化采用HPLC法建立20批不同产地藏药三果汤的指纹图谱,并对其相似度进行评价,同时结合HCA、PCA和OPLS-DA等化学模式识别方法以评价20批样品之间的差异。此外,对不同产地藏药三果汤中没食子酸、柯里拉京、1,2,3,6-四-O-没食子酰-β-D-葡萄糖、诃黎勒酸、1,2,3,4,6-O-五没食子酰基葡萄糖、诃子酸和鞣花酸这7种酚类化合物进行定量分析,优选出总含量最高的产地。同时,以这7种化合物的总含量为指标,通过正交实验法,考察加水量、提取温度及提取时间对藏药三果汤化合物溶出的影响。2.高糖诱导βTC-6细胞凋亡模型的建立MTT法测定βTC-6细胞的生长曲线,确定细胞最佳接种密度。分别采用MTT法和ELISA法测定不同葡萄糖浓度(11.1、25、38.8、50 mmol/L)对βTC-6细胞增殖和胰岛素分泌的影响,同时加入不同浓度的甘露醇(11.1、25、38.8、50mmol/L),观察渗透压对βTC-6细胞的影响,明确葡萄糖的毒性作用。3.藏药三果汤含药血清通过Wnt/β-catenin信号通路抑制高糖状态下胰岛β细胞凋亡的机制研究不同浓度的藏药三果汤含药血清与高糖状态下的βTC-6细胞联合培养后,采用MTT法检测其对βTC-6细胞增殖的影响;采用QRT-PCR法检测βTC-6细胞中TXNIP、TRX-1、Caspase-3、Caspase-9、β-catenin、GSK-3β、c-Myc、Cyclin D1、TCF7L2、DKK1 mRNA的表达;采用Western Blot法检测βTC-6细胞中TXNIP、Bax、TCF7L2、DKK1蛋白的表达。4.藏药三果汤通过Wnt/β-catenin信号通路抑制糖尿病大鼠胰岛β细胞凋亡的机制研究55只雄性Wistar大鼠分为正常组和造模组,造模组采用单次腹腔注射48mg/kg的链脲佐菌素建立糖尿病大鼠模型,正常组注射等剂量的缓冲液。建模成功后,造模组依次分为模型组、藏药三果汤低剂量组、藏药三果汤中剂量组、藏药三果汤高剂量组、阳性药西格列汀组,分别灌胃给药干预8周,并每周监测各组大鼠血糖和体重。ELISA法检测各组大鼠外周血清中INS、GCG、SST、PP、GLP-1水平,HE染色检测各组大鼠的胰岛变化;免疫组化染色检测各组大鼠胰腺组织中INS、GCG、SST、PP、β-catenin的阳性表达;QRT-PCR法检测各组大鼠胰腺组织中β-catenin、GSK-3β、Caspase-3等因子mRNA的表达。5.藏药三果汤对糖尿病大鼠血清代谢组的影响研究采用LC-MS/MS技术对糖尿病大鼠的血清代谢物进行非靶向检测,分析正常组、模型组、西格列汀阳性药组和藏药三果汤高剂量组之间的代谢物差异和联系,并分析其主要代谢途径,初步探讨藏药三果汤改善糖尿病大鼠血清代谢紊乱的机制,为藏药三果汤治疗糖尿病提供进一步的实验基础。结果:1.不同产地藏药三果汤的指纹图谱建立及水提取工艺优化结果显示20批不同产地藏药三果汤样品指纹图谱有19个共有峰,与对照指纹图谱的相似度为0.984～0.996,表明来自不同产地的20批样品之间具有良好的一致性,可以用来综合评价其整体质量。化学计量学结果分析得知,20批不同产地藏药三果汤样品分为两类,即诃子产地为国外,如老挝、泰国、越南的分为一类,诃子产地为中国国内省份的分为一类。通过与对照品比较,指认出7个共有峰,分别为没食子酸、柯里拉京、1,2,3,6-四-O-没食子酰-β-D-葡萄糖、诃黎勒酸、1,2,3,4,6-O-五没食子酰基葡萄糖、诃子酸和鞣花酸,其中OPLS-DA的VIP图筛选出诃子酸、诃黎勒酸、柯里拉京是20批样品产生差异的主要化合物。对20批不同产地的藏药三果汤进行定量分析,发现诃子产地为广西南宁,毛诃子产地为云南大理,余甘子产地为广东普宁组成的三果汤化合物总含量最高,且加水量为30倍量,在90℃的提取温度下提取30分钟为三果汤的最佳提取方法。2.高糖诱导βTC-6细胞凋亡模型的建立绘制生长曲线,确定βTC-6细胞最佳接种密度为6.67×10^4个/m L。葡萄糖浓度为50 mmol/L时对βTC-6细胞抑制率最高,胰岛素分泌显著降低,可诱导细胞高糖凋亡模型。甘露醇浓度对βTC-6细胞的增殖无明显抑制作用,明确了葡萄糖的高糖毒性。3.藏药三果汤含药血清通过Wnt/β-catenin信号通路抑制高糖状态下胰岛β细胞凋亡的机制研究不同浓度的藏药三果汤含药血清与高糖状态下的βTC-6细胞联合培养24小时后,MTT法检测结果显示含药血清可提高高糖状态下βTC-6细胞的存活率;QRT-PCR法结果显示,含药血清可显著下调βTC-6细胞中促凋亡因子TXNIP、Caspase-3、Caspase-9和Wnt/β-catenin信号通路相关调节因子β-catenin、GSK-3β、c-Myc、Cyclin D1等mRNA表达水平,及上调凋亡抑制因子TRX-1、Wnt/β-catenin信号通路抑制因子DKK1和关键效应因子TCF7L2的mRNA表达水平;Western blot法结果显示,含药血清可显著下调TXNIP、Bax蛋白的表达,上调DKK1、TCF7L2蛋白的表达。4.藏药三果汤通过Wnt/β-catenin信号通路抑制糖尿病大鼠胰岛β细胞凋亡的机制研究藏药三果汤可降低糖尿病大鼠的血糖并增加体重。ELISA法结果显示,藏药三果汤可显著降低糖尿病大鼠外周血清中GCG、SST、PP和升高INS、GLP-1水平;HE染色结果显示给药组可增加糖尿病大鼠的胰岛面积,且胰岛与周围细胞间的界限更加清晰,其中藏药三果汤中、高剂量组最明显;免疫组化染色结果显示藏药三果汤可增强糖尿病大鼠胰腺组织中INS的阳性表达,减弱GCG、SST、PP及β-catenin的阳性表达;QRT-PCR法结果显示,给药组可下调糖尿病大鼠胰腺组织中β-catenin、GSK-3β和凋亡执行蛋白酶Caspase-3的mRNA表达水平。5.藏药三果汤对糖尿病大鼠血清代谢组的影响研究血清代谢组学分析结果显示,与模型组比较,藏药三果汤给药组共鉴定出210个差异代谢物,其中上调116个,下调94个;与阳性药组比较,有86个差异代谢物,其中上调44个,下调42个。KEGG代谢通路分析结果显示,藏药三果汤治疗糖尿病的主要途径与神经活性配体-受体相互作用、苯丙氨酸-酪氨酸-色氨酸生物合成、氨基酸代谢及甘油磷脂代谢等途径有关。结论:藏药三果汤对高浓度葡萄糖诱导βTC-6细胞凋亡和STZ诱导大鼠胰岛细胞凋亡有一定抑制作用。此方可减少促凋亡因子和增加凋亡抑制因子的表达,从而抑制胰岛β细胞凋亡,对糖尿病治疗具有良好的疗效,其作用机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。

摘要译文

关键词：

高糖; 胰岛β细胞凋亡; 藏药三果汤; Wnt/β-catenin信号通路

学位年度：

2024

学位类型：

硕士

学科专业：

中药学

导师：

范源

中图分类号：

R29[中国少数民族医学]

学科分类号：

030402[中华民族学];100516[民族医学];100809[民族药学]

D O I：

10.27460/d.cnki.gyzyc.2024.000555