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基于甜味受体的玉竹多糖降血糖作用机理研究认领

被引量： 7

作者：

柳婷

学位授予单位：

江西中医药大学

摘要：

目的:从甜味受体的角度阐明玉竹多糖的降血糖机理,为玉竹多糖及玉竹的临床应用、质量评价提供实验依据,为降血糖机理研究提供新的视角。方法:1.玉竹多糖的制备及表征采用水提醇沉法制备粗多糖,再利用透析膜去除小分子物质得到纯化多糖;在此基础上,采用苯酚-硫酸法测定纯化多糖中多糖的含量,采用考马斯亮蓝G-250法测定其中蛋白质的含量,采用HPLC-ELSD法测定其中低分子糖的含量,对玉竹多糖的纯度及杂质进行表征;采用PMP柱前衍生-HPLC法分析玉竹多糖中单糖的组成,采用红外光谱法分析玉竹多糖中的官能团结构,进一步对玉竹多糖的结构进行表征。2.玉竹多糖对甜味受体的影响以HuTu-80细胞为模型,探索玉竹多糖对甜味受体T1R2、T1R3的影响。首先采用RT-PCR方法,验证HuTu-80细胞中甜味受体T1R2、T1R3的表达;确证后,再以玉竹多糖干预HuTu-80细胞,一定时间后加入葡萄糖启动甜味受体信号通路,然后采用ELISA方法测定细胞内c AMP及细胞外GLP-1的浓度,采用激光共聚焦技术检测细胞内Ca2+的荧光强度,采用q PCR法检测甜味受体T1R2、T1R3的表达,从细胞模型的角度,探索玉竹多糖对甜味受体的影响。3.玉竹多糖降血糖作用机理的研究在确证玉竹多糖对甜味受体存在作用的基础上,接下来以整体动物模型,从甜味受体的角度阐明玉竹多糖降血糖作用机制。采用“高脂高糖饮食喂养+STZ”方法建立糖尿病大鼠模型,考察玉竹多糖对糖尿病大鼠的体重、空腹血糖、血脂的影响;采用苏木素-伊红染色法,研究玉竹多糖对糖尿病大鼠胰腺、肝脏组织形态学的影响;采用口服葡萄糖耐量实验,研究玉竹多糖对糖尿病大鼠糖耐量的影响。在此基础上,进一步进行胰岛素释放实验,采用ELISA方法测定GLP-1的浓度,采用q PCR方法,研究玉竹多糖对T1R2、T1R3、α-gustducin、TRPM5、SGLT-1、GLUT-2基因m RNA表达的影响,从甜味受体的角度阐明玉竹多糖降血糖的作用机制。结果:1.玉竹多糖的制备与表征对玉竹纯化多糖进行表征,结果显示,玉竹多糖的纯度为88.29%,蛋白质含量为0.19%,且不含有葡萄糖、木糖、鼠李糖、果糖、蔗糖等低分子糖;单糖组成分析结果显示,玉竹多糖由甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖等5种单糖组成,其摩尔比为21.08:2.31:14.13:3.32:0.41;红外光谱分析结果显示,玉竹多糖是一种含有羧基、β型糖苷键、吡喃环结构,可能含有α型糖苷键的多糖。2.玉竹多糖对甜味受体的影响RT-PCR结果显示,HuTu-80细胞内存在甜味受体的表达。玉竹多糖与HuTu-80细胞共孵育48 h后,加入葡萄糖后,与正常对照组比较,玉竹多糖低、高剂量组c AMP、GLP-1的浓度显著增加（P<0.05）;激光共聚焦结果显示,与正常对照组比较,玉竹多糖低、高剂量组HuTu-80细胞内钙离子的荧光强度增加;同时,与正常对照组比较,玉竹多糖低、高剂量组HuTu-80细胞中甜味受体T1R2、T1R3基因m RNA表达显著增加（P<0.05）。以上结果表明,玉竹多糖可促进甜味受体的表达,增强葡萄糖启动的甜味受体信号通路强度。3.玉竹多糖降血糖作用机理研究肠道甜味受体信号通路启动后一个主要效应是促进GLP-1的分泌,进而降血糖。因此,在以上实验的基础上,进一步采用糖尿病整体动物模型研究玉竹多糖的降血糖作用。结果显示,与正常组比较,模型组大鼠体重明显减轻（P<0.05）,空腹血糖明显上升（P<0.05）,同时TG、TC、LDL-C的含量显著上升（P<0.05）,HDL-C含量明显下降（P<0.05）。给予玉竹多糖后,与模型组比较,玉竹多糖中、高剂量组显著增加了糖尿病大鼠的体重（P<0.05）,降低了空腹血糖水平和TG、TC、LDL-C浓度（P<0.05）,且玉竹多糖高剂量组还显著增加了糖尿病大鼠HDL-C的浓度（P<0.05）。病理学结果显示,与正常组相比,模型组大鼠胰岛严重萎缩变形,胰岛细胞边界消失;给予中、高剂量的玉竹多糖后,胰岛面积明显增大,结构趋向完整,边界清晰;同时,给予中、高剂量的玉竹多糖后,大鼠肝细胞内液态积聚减少,且受损细胞数量减少。口服葡萄糖耐量实验结果显示,与正常组比较,模型组大鼠的血糖曲线下面积显著增大（P<0.05）;给药玉竹多糖7周后,玉竹多糖中、高剂量组大鼠血糖曲线下面积明显降低（P<0.05）。再研究玉竹多糖降血糖的作用机制。玉竹多糖对GLP-1含量影响结果显示,与正常组比较,模型组大鼠血清中GLP-1含量显著降低（P<0.05）;玉竹多糖治疗后,玉竹多糖中、高剂量组大鼠血清中GLP-1含量明显增加（P<0.05）;胰岛素释放实验结果显示,模型组大鼠血清胰岛素含量在各个时间点均显著低于正常组（P<0.05）,血清中胰岛素含量低水平持续增长,未出现胰岛素分泌高峰;给药玉竹多糖后,与模型组比较,玉竹多糖中、高剂量组血清胰岛素含量在各时间点均明显高于模型组（P<0.05）,且均在第1 h时出现胰岛素分泌高峰。以上结果表明,玉竹多糖可促进GLP-1分泌,进而促进胰岛素的分泌。在此基础上,进一步研究玉竹多糖对甜味受体信号通路的影响。结果显示,与正常组比较,模型组大鼠T1R2、T1R3、α-gustducin、TRPM5基因m RNA表达均显著下降（P<0.05）,SGLT-1、GLUT-2基因m RNA表达明显增加（P<0.05）;给药玉竹多糖后,与模型组比较,玉竹多糖中剂量可明显促进T1R3、TRPM5基因m RNA的表达（P<0.05）,玉竹多糖高剂量可明显促进T1R2、T1R3、α-gustducin、TRPM5基因m RNA的表达（P<0.05）,而玉竹多糖对SGLT-1、GLUT-2的m RNA表达无明显影响。以上结果表明,玉竹多糖可通过增强甜味受体信号通路,发挥降血糖作用。结论:玉竹多糖通过促进甜味受体T1R2、T1R3及信号分子α-gustducin、TRPM5的表达,增强甜味受体信号通路,在葡萄糖的介导下,促进GLP-1分泌增加,进而促进胰岛素的分泌增加,发挥降血糖作用。

摘要译文

关键词：

玉竹多糖; 降血糖; 甜味受体

学位年度：

2022

学位类型：

硕士

学科专业：

中药学

导师：

杨华生

中图分类号：

R285[中药药理学]

学科分类号：

100505[临床中药学];100801[中药资源学];100806[中药药理学];100808[临床中药学]

D O I：

10.27180/d.cnki.gjxzc.2022.000254