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TXNIP-NLRP3炎性小体通路在Ang Ⅱ诱导的胰岛β细胞凋亡中的作用认领

被引量： 1

作者：

冯艳金

学位授予单位：

山西医科大学

摘要：

研究背景:随着居民生活水平的提高,糖尿病在我国的发病率逐年提升,已然成为当前社会最主要的健康杀手。糖尿病是遗传因素和环境因素共同影响而引起的疾病,造成其病情恶化的最主要原因为胰岛β细胞的损伤和数目的减少。近年来发现,肾素-血管紧张素系统（Renin-angiotensin system,RAS）在局部胰腺组织中存在表达,更重要的是在糖尿病时RAS激活,致使其主要的效应物质,血管紧张素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ）水平升高,而后者的过表达会引起胰岛功能紊乱和胰岛β细胞凋亡增加,但其具体机制尚不明确。越来越多的研究证实,慢性炎症反应是导致糖尿病发生发展的重要因素。NLRP3炎性小体是一种多蛋白复合物,在各种病原刺激下发生活化,随后继续激活Pro Caspase-1,使其裂解为Caspase-1 p10活性片段,后者通过促进成熟的IL-1β的分泌而诱发细胞炎症损伤。关于NLRP3炎性小体的活化机制众说纷纭,但氧化应激引发ROS生成增多,进而促进TXNIP过表达或与NLRP3结合增多是其最主要的激活途径。因此,本研究旨在探讨Ang Ⅱ发挥胰岛β细胞损伤作用是否通过TXNIP-NLRP3炎性小体通路而实现。目的:1.使用Ang Ⅱ刺激正常大鼠胰岛组织,观察其对胰岛β细胞分泌胰岛素水平的影响;2.Ang Ⅱ孵育正常大鼠胰岛及INS-1胰岛β细胞,观察其对胰岛细胞凋亡及NLRP3炎性小体表达的影响;3.探究Ang Ⅱ影响NLRP3炎性小体表达的具体机制。方法:1.动物实验:构建糖尿病大鼠模型,分离胰岛并检测Ang Ⅱ水平;2.离体实验:（1）分离正常大鼠胰岛组织,使用Ang Ⅱ刺激,ELISA法检测胰岛素分泌量;（2）Western Blot检测Ang Ⅱ对胰岛凋亡及NLRP3炎性小体表达的影响;（3）CCK-8检测不同浓度(0、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-55 mol/L)及不同作用时间（0、6、12、24、48 h）的Ang Ⅱ对INS-1胰岛β细胞存活率的影响;（4）流式细胞术及Western Blot检测Cleaved Caspase-3/Caspase-3,探究Ang Ⅱ对INS-1胰岛β细胞凋亡的影响;（5）Western Blot检测Ang Ⅱ作用下INS-1胰岛β细胞NLRP3炎性小体、TXNIP、ChREBP、AT1R的表达情况;（6）RT-PCR检测Ang Ⅱ对INS-1胰岛β细胞TXNIP、ChREBP的mRNA水平的表达影响;（7）IF/ICC法观察Ang Ⅱ处理对INS-1胰岛β细胞TXNIP、ChREBP及AT1R的表达影响。结果:1.糖尿病鼠胰岛组织中Ang Ⅱ含量升高分离糖尿病鼠胰岛,ELISA实验检测胰岛中Ang Ⅱ含量的结果显示,T1DM组Ang Ⅱ水平显著上调（P<0.01,n=7）;T2DM组的Ang Ⅱ含量也明显升高（P<0.01,n=7）。（见图1）2.Ang Ⅱ对原代胰岛的功能及蛋白表达的影响2.1 Ang Ⅱ可以降低胰岛β细胞的胰岛素分泌水平检测胰岛功能显示,Ang Ⅱ组葡萄糖刺激的胰岛素分泌指数降低（P<0.05,n=6）,说明Ang Ⅱ造成胰岛功能受损。（见图2A-C）2.2 Ang Ⅱ可以诱导胰岛细胞凋亡Western Blot结果表明,与对照组相比,Ang Ⅱ组Cleaved Caspase-3/Caspase-3比值升高（P<0.01,n=6）,提示Ang Ⅱ诱导胰岛细胞凋亡增加。（见图2D）2.3 Ang Ⅱ可以激活胰岛细胞NLRP3炎性小体与对照组相比,Ang Ⅱ组的NLRP3、ASC、Caspase-1的活性片段p10的蛋白表达均升高（P<0.01,n=6;P<0.01,n=6;P<0.05,n=6）,培养液中IL-1β的分泌增多（P<0.01,n=6）,说明Ang Ⅱ可引起NLRP3炎性小体的激活。（见图2E、F）3.Ang Ⅱ诱导INS-1胰岛β细胞存活率下降CCK-8结果显示,随着Ang Ⅱ作用浓度的升高,INS-1胰岛β细胞存活率逐渐下降,在1×10-6mol/L时作用显著（P<0.01,n=6）;给予INS-1胰岛β细胞孵育Ang Ⅱ不同时间,发现随着Ang Ⅱ作用时间的延长,细胞存活率逐渐降低,Ang Ⅱ作用24 h时细胞活力显著下降（P<0.01,n=6）。（见图3）4.Ang Ⅱ促进INS-1胰岛β细胞凋亡流式细胞术结果显示,Ang Ⅱ组细胞凋亡率相比对照组升高（P<0.05,n=6）。Western Blot方法检测Caspase-3及Cleaved Caspase-3,Ang Ⅱ组CleavedCaspase-3/Caspase-3比值升高（P<0.05,n=6）。（见图4）5.Ang Ⅱ通过NLRP3炎性小体诱导INS-1胰岛β细胞凋亡与对照组相比,Ang Ⅱ组NLRP3、ASC的蛋白表达均上调（P<0.05,n=6）,Caspase-1的活性成分p10片段表达明显升高（P<0.05,n=6）,细胞培养上清的IL-1β分泌量显著升高（P<0.01,n=6）。（见图5A、B）NLRP3炎性小体的活化抑制剂MCC950(1×10-5mol/L),抑制了NLRP3炎性小体的活化后,Caspase-1 p10片段蛋白表达显著下调（P<0.01,n=6）、细胞上清中IL-1β分泌量也显著减少（P<0.01,n=6）。同时,与Ang Ⅱ组相比,MCC950+Ang Ⅱ组Cleaved Caspase-3/Caspase-3比值显著降低（P<0.01,n=6）。说明Ang Ⅱ可通过激活NLRP3炎性小体诱导INS-1胰岛β细胞凋亡。（见图5C、D）6.TXNIP介导Ang Ⅱ诱导的NLRP3炎性小体的表达及胰岛β细胞凋亡Ang Ⅱ刺激INS-1胰岛β细胞引起TXNIP的mRNA和蛋白水平表达上调,且具有浓度依赖性和时间依赖性,在1×10-6mol/L时升高程度显著（P<0.01,n=6）;Ang Ⅱ作用24 h时TXNIP表达升高的程度明显（P<0.05,n=6）;Ang Ⅱ(1×10-6mol/L,24 h)处理INS-1胰岛β细胞,免疫细胞化学染色后发现,Ang Ⅱ组胞质内TXNIP表达增多。（见图6A-E）通过TXNIP shRNA感染INS-1细胞,抑制TXNIP的表达后可见,与Scramble shRNA+Ang Ⅱ组相比,TXNIP shRNA+Ang Ⅱ组NLRP3、ASC、Caspase-1 p10蛋白表达显著下调（P<0.01,n=6）,Cleaved Caspase-3/Caspase-3显著降低（P<0.01,n=6）,上清IL-1β含量降低（P<0.01,n=6）。提示,TXNIP参与介导了Ang Ⅱ活化NLRP3炎性小体及INS-1细胞凋亡。（见图6F-I）7.ChREBP参与Ang Ⅱ诱导INS-1细胞凋亡Ang Ⅱ刺激INS-1细胞后,与对照组相比,Ang Ⅱ组ChREBP的mRNA和蛋白表达水平均上调（P<0.05,n=7）。免疫荧光结果显示,Ang Ⅱ组ChREBP表达高于对照组,且从细胞质内表达变为细胞核内表达,提示ChREBP被Ang Ⅱ激活,并且表达增多。（见图7）8.AT1R介导Ang Ⅱ引发的NLRP3炎性小体活化及INS-1胰岛β细胞凋亡Western Blot结果显示,Ang Ⅱ组AT1R蛋白表达水平相比对照组明显升高（P<0.05,n=6）。免疫荧光结果示,Ang Ⅱ组AT1R红色荧光明显多于对照组。（见图8A、B）使用AT1R特异性的抑制剂替米沙坦预处理INS-1细胞1 h(1×10-5mol/L),TM+Ang Ⅱ组细胞活力明显增强（P<0.01,n=6）,Cleaved Caspase-3/Caspase-3比值低于Ang Ⅱ组（P<0.05,n=6）。说明AT1R介导Ang Ⅱ降低INS-1细胞活力以及诱导细胞凋亡的过程。（见图8C、D）为进一步探究AT1R在Ang Ⅱ引起NLRP3炎性小体活化和TXNIP表达升高过程中的作用,我们观察了替米沙坦作用后NLRP3炎性小体、TXNIP、ChREBP的表达情况。结果显示,与Ang Ⅱ组相比,TM+Ang Ⅱ组NLRP3、ASC蛋白表达下调（P<0.05,n=6）、Caspase-1 p10片段表达降低（P<0.05,n=6）、细胞培养上清中IL-1β含量明显减少（P<0.01,n=6）;同时,TXNIP的mRNA和蛋白水平均明显降低（P<0.01,n=6）、ChREBP mRNA和蛋白水平上调也被替米沙坦抑制（P<0.05,n=6）。综上所述,Ang Ⅱ通过AT1R发挥影响INS-1细胞的下游作用。（见图8E-J）结论:1.Ang Ⅱ可以抑制胰岛素分泌,促进胰岛β细胞凋亡;2.TXNIP-NLRP3炎性小体通路介导Ang Ⅱ诱发的INS-1胰岛β细胞凋亡增加;3.AT1R介导Ang Ⅱ引发的NLRP3炎性小体活化及INS-1胰岛β细胞凋亡。

摘要译文

关键词：

Ang Ⅱ; NLRP3炎性小体; TXNIP; AT1R

学位年度：

2018

学位类型：

硕士

学科专业：

生理学

导师：

焦向英

中图分类号：

R587.1[糖尿病⑨]

学科分类号：

100201[内科学]