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GLP1在奥氮平介导糖代谢紊乱中的作用及其分子机制认领

被引量： 1

作者：

李德娟

学位授予单位：

西南大学

摘要：

背景与目的:精神分裂症是一种严重的慢性精神障碍,患者的预期寿命比一般人群短14-20年且死亡率高,其中35%的自然死亡归因于心血管疾病和糖尿病。精神分裂症主要以药物治疗为主,其中以奥氮平(Olanzapine,Ola)为代表的非典型抗精神病药物(Atypical antipsychotic drugs,AAPDs)在临床上使用最为广泛,但是伴随着治疗作用的同时此类药物可引起严重的代谢性副作用,如体重增加、肥胖、高脂血症、胰岛素抵抗和糖尿病,不仅影响患者服药依从性,还会加剧患糖尿病风险甚至导致死亡。所以AAPDs引起的糖代谢性不良反应需要重点关注,阐明AAPDs诱导糖代谢紊乱的机制对于其不良反应的预防和治疗及其临床治疗结局极为重要。GLP1是一种具有多种降血糖作用的新型药理学靶标,可作用于多个靶器官,包括胰腺、胃肠道、大脑等,在维持糖代谢稳态中发挥重要作用。虽然有临床试验表明GLP1R激动剂利拉鲁肽(Liraglutide,Lir)在缓解AAPDs引起的肥胖和糖耐量受损方面具有比二甲双胍更好的潜在优势,但是目前联合用药的临床证据和机制并不充分,干预药物的选择仍存在争议,因此需要更多基础研究来确定干预药物的有效性及相关机制。方法与结果:1.AAPDs对大鼠糖代谢的影响选择AAPDs中临床使用量最多的Ola和治疗青少年精神分裂症的主要药物阿立哌唑(Aripiprazole,Ari)以及上市新药依匹哌唑(Brexpiprazole,Bre)为这部分的受试药物,系统地考察这三种AAPDs的糖代谢副反应程度,初步确定一种代表药物来开展后续的机制探究实验。选取180～200 g SD大鼠随机分为四组:溶媒对照组(Veh)、Ola给药组(Ola,1 mg/kg,oral),Ari给药组(Ari,1 mg/kg,oral),Bre给药组(Bre,0.5 mg/kg,oral),每组12只,雌雄各半,通过训练自主口服给药处理28天,隔天测定大鼠体重和进食,每周测定空腹血糖,给药结束前通过OGTT和ITT分别测定大鼠的葡萄糖耐受和胰岛素耐受情况,给药结束收集大鼠血清及各个组织展开后续检测。结果显示,AAPDs处理后,大鼠体重、血脂(TG、TC、LDL、FFA)和血糖(FBG、GSP)明显升高且雌性较雄性大鼠的体重及血糖增加更明显。用ELISA法测定血清中代谢相关激素水平,发现Ola和Bre显著降低了餐后Insulin和GLP1的水平(P<0.05),进一步通过Pearson相关性分析发现GLP1与体重和血糖呈现显著负相关性,表明GLP1可能在AAPDs介导的葡萄糖和脂质代谢紊乱中起关键作用,可以围绕GLP1进一步开展研究。OGTT和ITT实验证实了AAPDs易引起糖耐量和胰岛素敏感性受损。通过IHC、HE染色和WB、q PCR分析,主要得到如下结果:Ola和Bre均能显著抑制胰腺和小肠GLP1的蛋白和m RNA水平(P<0.05);Ola和Bre处理后胰腺GLP1R、PI3K、IRβ表达降低,引起胰岛功能障碍;Ola和Bre通过干扰肝脏和骨骼肌中IRS1、PI3K、p-AKT和GLUT4的表达,诱导胰岛素抵抗。Ola,Ari和Bre均有引起体重增加,血糖升高,胰岛功能障碍和胰岛素抵抗的风险,但是三者的反应程度不完全一致,Ola引起的体重增加和血糖升高是最显著的,其次是Bre,而Ari引起的代谢紊乱并没有达到统计学意义的显著性。因此我们选择Ola为代表药物进一步深入地去进行机制探究,并在后续研究中选择反应性更强的雌性作为研究对象。2.GLP1参与奥氮平介导的糖代谢紊乱为了进一步确认GLP1是否作为Ola介导糖代谢紊乱的靶标,首先将第一部分实验中Ola处理组雌性大鼠的小肠组织进行转录组学测序。通过差异表达基因分析共发现2870个差异表达基因,相对于Veh组,Ola组显著上调的基因总数为806个,下调基因总数为1683个。接着将所有差异基因进行了GO富集分析和KEGG富集分析,发现差异表达基因主要参与生化代谢途径和信号转导途径,包括脂肪酸合成、延长与分解以及糖酵解/糖异生,经过筛选脂肪酸代谢富集到的5个显著变化基因有:Slc27a2、Cpt1a、Fasn、Acaca、Evol4,糖酵解富集到的显著变化的5个基因分别是:G6pc、Hk2、Pfkm、Adpgk、Glp1。KEGG pathway显示Ola作用后,小肠组织中钙离子信号通路、c AMP信号通路、PPAR信号通路及胰岛素分泌等信号通路发生了显著变化。结合第一部分实验结果及文献调研我们选择了GLP1、PPARγ为兴趣靶点进行后续研究。然后选取42例临床服用Ola的女性精神分裂症患者进行了为期1年的动态观察,考察Ola对患者糖代谢及GLP1、PPARγ表达的影响,进一步明确GLP1在Ola介导的代谢性副反应中的作用以及PPARγ与GLP1的相关性。在基线期(用药前)、用药1个月、用药2个月和用药12个月时对各临床指标(体重、腰臀围、血糖血脂等)进行监测,并采用ELISA法测定患者血清中Insulin、GLP1及PPARγ的表达。结果显示,患者的平均体重、体重指数、腰围及腰臀比在整个服药过程中显著增加(P<0.05);患者服用Ola后血清中TG、LDL、GLU及GSP较基线时显著升高(P<0.001),而血清中HDL、Insulin、GLP1及PPARγ相对于基线水平显著降低(P<0.01)。通过Pearson相关性分析发现患者Insulin含量与GLP1水平呈现极显著的正相关性(r=0.9052,P<0.0001),GLP1与PPARγ具有显著的正相关性(r=0.7324,P<0.0001),确定了GLP1参与了Ola介导的大鼠和精神分裂症患者的代谢性副反应。3.奥氮平通过M1R/PPARγ/β-Catenin通路调控GLP1分泌在确认GLP1可能作为Ola介导糖代谢紊乱的靶标后,选择研究GLP1分泌常用的小肠内分泌STC-1细胞系来开展Ola对GLP1分泌调控的机理研究。首先使用CCK8法筛选Ola的安全浓度,并选择低中高三个浓度梯度(1.25、5、20μM)作用于STC-1细胞。通过ELISA测定发现随着Ola浓度的增加STC-1细胞中GLP1分泌量逐渐减少;通过IF双重染色确定了STC-1细胞中的GLP1主要定位于细胞质而PPARγ定位于细胞核和细胞质中,并且两者荧光强度被Ola剂量依赖性地减少;通过WB及q PCR实验发现Ola能显著抑制GLP1、PPARγ、AMPK、PKC以及TCF4的表达,同时上调FOXO3的表达,并呈现一定的剂量依赖性(P<0.05)。为了进一步考察Ola是否通过PPARγ实现对GLP1的转录调控,我们建立了PPARγ过表达的STC-1细胞模型。结果显示PPARγ过表达质粒转染细胞后,细胞中PPARγ的m RNA与蛋白水平以及GLP1的分泌量发生了极显著的上调(P<0.01)。在PPARγ过表达质粒与Ola(20μM)联合使用时,GLP1的分泌量及m RNA表达量较Ola单用时显著增加(P<0.01),同时伴随着FOXO3的显著下调及TCF4的显著上调(P<0.05)。IF染色显示PPARγ过表达促进了β-Catenin的入核。进一步通过Co-IP实验发现PPARγ与β-Catenin能形成复合物,而Ola处理后能减少与PPARγ复合的β-Catenin的量。上述结果表明Ola可以通过PPARγ介导对GLP1的调控,PPARγ能促进GLP1转录因子β-Catenin入核并与TCF4形成转录复合物发挥对GLP1转录调控的功能,另一方面也能通过抑制FOXO3,减少对TCF4/β-Catenin复合物的竞争性抑制,促进GLP1的转录。接着为了考察Ola的药理靶点M1R是否作为PPARγ的上游靶点发挥对STC-1细胞GLP1分泌调控的直接作用,我们引入了M1R激动剂氯贝胆碱(Bethanechol,Beth)进一步探究Ola抑制GLP1分泌的可能机制。结果显示,M1R激动剂与Ola联用时能恢复Ola对GLP1分泌的阻滞作用(P<0.05)。通过WB和q PCR分析发现M1R激动剂能增加PKC、AMPK的表达,引起PPARγ及下游β-Catenin、TCF4信号的激活,最终缓解由Ola介导的GLP1的蛋白和转录水平的抑制(P<0.05)。此外,钙离子探针染色发现M1R激动剂与Ola联用能显著增加细胞内钙离子浓度(P<0.05),促进GLP1的分泌。4.GLP1类似物利拉鲁肽能有效缓解奥氮平引起的糖代谢异常首先通过动物实验探索GLP1类似物Lir能否有效缓解Ola长期使用引起的糖代谢异常。选取32只180～200 g SD雌性大鼠随机分为四组:空白对照组(Con)、Lir给药组(Lir,0.125 mg/kg,i.p.)、Ola给药组(Ola,1 mg/kg,oral)、Ola与Lir联合给药组(O+L,1 mg/kg Ola,oral;0.125 mg/kg Lir,s.c.)。给药处理42天后,Ola组大鼠的体重、血脂及血糖较Con组明显升高(P<0.05),而Lir与Ola联合处理能降低Ola引起的体重增加和血脂血糖升高;OGTT实验发现O+L可以明显改善Ola引起的糖耐量异常(P<0.05);ELISA分析发现Lir能够回补Ola导致的胰岛素分泌不足;WB实验显示,Lir能上调胰腺中被Ola抑制的PKA、GLP1R、PI3K分子信号,从而缓解胰岛损伤,并且能显著上调PI3K/AKT信号,从而改善肝脏胰岛素抵抗(P<0.05)。上述结果证实了Ola长期给药会引起大鼠糖代谢异常,而联合使用Lir能降低体重增加、血糖升高、胰岛功能损伤和胰岛素抵抗的风险,可以明显改善Ola引起的糖代谢异常。为了进一步研究Lir缓解Ola糖代谢异常的机制,我们选择胰岛β细胞MIN6细胞系,来考察Ola及Lir对β细胞质量及胰岛素分泌的影响。首先使用CCK8法测定Ola对MIN6细胞存活率的影响,结果显示100μM以内Ola能剂量依赖性地减少MIN6细胞的存活率。然后选择低中高三个浓度梯度(5、10、20μM)Ola并同时引入Lir联合作用于MIN6细胞:通过ELISA法发现随着Ola浓度的增加胰岛素分泌量逐渐减少,而Lir联合Ola(20μM)能促进胰岛素的分泌(与Ola单用相比,P<0.05);IF染色显示MIN6细胞GLP1及其受体表达被Ola显著抑制(P<0.05),Lir联用能激活GLP1R而不影响GLP1表达;钙离子探针染色发现Lir联用能显著缓解Ola介导的钙离子水平降低;WB及q PCR实验发现Ola能显著抑制PKA、CREB的磷酸化及胰岛素转录相关基因Creb、Pdx1的表达,而联合Lir处理时上述因子较Ola单药处理时显著增加(P<0.05),说明Lir能逆转Ola对MIN6细胞胰岛素合成的抑制。最后分别构建了GLP1R过表达及沉默的MIN6细胞模型,进一步验证GLP1与Ola对胰岛功能调节的机制。结果显示,与Lir联合处理不同的是,GLP1R过表达质粒联合Ola处理细胞时,被Ola减少的MIN6细胞的胰岛素分泌量并未得到较好的提升。但在GLP1R沉默的模型中发现胰岛素分泌合成显著减少,同时减少的还有GLP1R激活后的下游信号,包括PKA和CREB等信号(P<0.05)。上述结果表明GLP1/GLP1R信号参与Ola介导的糖代谢异常,其中Ola引起GLP1合成减少为关键因素。结论:Ola表现出比Bre和Ari更强的代谢性不良反应,可显著增加SD大鼠的体重及空腹血糖,并且雌性大鼠的变化较雄性大鼠更明显。Ola作用后小肠组织中的差异表达基因主要集中在糖脂代谢生物过程中,通过临床病人样本进一步证实了GLP1和PPARγ可以作为Ola导致代谢性紊乱的候选靶点。通过STC-1细胞实验发现Ola可以通过抑制作用靶点M1R,引起PKC信号通路及PPARγ表达的抑制,从而减少GLP1转录因子β-Catenin的入核及转录复合物β-Catenin/TCF4的形成,最终抑制GLP1转录和分泌。

摘要译文

关键词：

奥氮平; 糖代谢异常; 利拉鲁肽; 胰高血糖素样肽1; 分子机制

学位年度：

2021

学位类型：

博士

学科专业：

生物药学

导师：

胡昌华

中图分类号：

R749.3[精神分裂症⑨]

学科分类号：

100211[精神医学]

D O I：

10.27684/d.cnki.gxndx.2021.003761